I. TUJUAN
1. Melakukan ekstraksi soxhlet
2. Melakukan solid-phase extraction
3. Mampu menganalisis hasil kromatogram HPLC

II. DASAR TEORI
1. Coklat
Cokelat merupakan tanaman perkebunan / industri berupa pohon yang dikenal di Indonesia sejak tahun 1560, namun baru menjadi komoditi yang penting sejak tahun 1951. Biji cokelat dapat diproses dan menghasilkan beberapa produk, produk olahan yang dihasilkan adalah : Bubuk cokelat (Cocoa powder), pasta cokelat (Cocoa liqour) dan lemak cokelat (Cocoa butter) (Anonim, warintek 2007). Lemak cokelat mempunyai kemampuan untuk menghambat oksidasi kolesterol LDL (kolesterol jahat) dan meningkatkan fungsi kekebalan tubuh, sehingga dapat mencegah risiko penyakit jantung koroner dan kanker. Cokelat juga mengandung theobromine dan caffein yang memberikan energi bagi tubuh. Cokelat mengandung theobromine yang dapat mencegah batuk. Lemak cokelat mempunyai warna putih-kekuningan dan mempunai bau khas cokelat. Lemak ini mempunyai sifat rapuh (brittle) pada suhu 25oC, tidak larut dalam air dan mencair pada 27 – 33oC.
2. Kafein
Kafein merupakan senyawa kimia alkaloid terkandung secara alami pada lebih dari 60 jenis tanaman terutama teh (1- 4,8 %), kopi (1-1,5 %), dan biji coklat (2,7-3,6 %). Kafein diproduksi secara komersial dengan cara ekstraksi dari tanaman tertentu serta diproduksi secara sintetis. Kebanyakan produksi kafein bertujuan untuk memenuhi kebutuhan industri minuman. Kafein juga digunakan sebagai penguat rasa atau bumbu pada berbagai industry makanan (Misra et al, 2008). Bersama-sama dengan teobromin dan teofilin, kafein, termasuk ke dalam senyawa kimia golongan xanthin. Kafein termetabolisme di dalam hati menjadi tiga metabolit utama yaitu paraxanthine (84%), theobromine (12%), dan theophylline (4%).
Gembar 1 Struktur Kafein

3. Teobromin
Theobromine adalah senyawa alkaloid, bersifat stimultan ringan, yang terdapat dalam cokelat. Theobromine dapat menstimulasi sel saraf kita, sehingga menimbulkan perasaan 'bersemangat' dan 'segar'. Selain sebagai stimultan, Theobromine juga dipercaya memiliki mood elevating effects. Secara kimiawi teobromin amat mirip dengan kefein. Meski bernama teobromin, tetapi senyawa ini sama sekali tidak mengandung bromin. Teobromin bersifat tidak larut dalam air, kristalin, dan pahit. Bewarna putih ataupun tak bewarna.

Gambar 2 Struktur Teobromin



4. Ekatraksi Soxlet
Ekstraksi adalah salah satu metode pemisahan yang didasarkan pada distribusi zat terlarut diantara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Berdasarkan fasanya, ektraksi dikelompokkan menjadi ekstraksi cair-cair dan padat-cair. Ektraksi cair-cair dilakukan untuk mendapatkan suatu senyawa dalam campuran berfasa cair dengan pelarut lain yang fasanya cair juga. Alat yang digunakan adalah corong pisah.
Ekstraksi padat-cair dilakukan bila ingin memisahkan suatu komponen dalam suatu padatan dengan menggunakan suatu pelarut cair. Alat yang digunakan adalah ektraktor soxhlet. Misalnya untuk mengekstrak minyak non-atsiri (senyawa yang terdapat pada bahan alam yang tidak mudah menguap). Larutan pengekstrak ditempatkan pada labu alas bulat, sampel yang akan dianalisis dibungkus dengan kertas saring ditempatkan dan pada tabung ekstraktor. Bagian ujung atas merupakan pendingin Allihn atau pendingin bola. Gambar ekstraktor soxhlet ditunjukkan pada gambar 1.

5. Solid – Phase Extraction (SPE)
Jika dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair, ekstraksi fase padat yang biasa disebut Solid Phase Extraction (SPE) merupakan teknik yang relatif baru akan tetapi SPE cepat berkembang sebagai alat yang utama untuk pra-perlakuan sampel atau untuk clean-up sampel-sampel yang kotor, misal sampel-sampel yang mempunyai kandungan matriks yang tinggi seperti garam-garam, protein, polimer, resin, dan lain – lain.
Keunggulan SPE dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair adalah:
1. Proses ekstraksi lebih sempurna
2. Pemisahan analit dari penganggu yang mungkin ada menjadi lebih efisien
3. Mengurangi pelarut organik yang digunakan
4. Fraksi analit yang diperoleh lebih mudah dikumpulkan
5. Mampu menghilangkan partikulat
6. Lebih mudah diotomatisasi
Karena SPE merupakan proses pemisahan yang efisien maka untuk memperoleh recovery yang tinggi (>99%) pada SPE lebih mudah dari pada ekstraksi cair-cair. Dengan ekstraksi cair-cair diperlukan ekstraksi beberapa kali untuk memperoleh recovery yang tinggi, sedangkan dengan SPE hanya dibutuhkan satu tahap saja untuk memperolehnya. Sementara itu kerugian SPE adalah banyaknya jenis cartridge (berisi penjerap tertentu) yang beredar di pasaran sehingga reprodusibilitas hasil bervariasi jika menggunakan cartridge yang berbeda dan juga adanya adsorpsi yang bolak-balit pada cartridge SPE.

Gambar 5 Solid Phase EXtraction

6. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
HPLC merupakan salah satu metode kromatografi cair yang menggunakan fasadiam yang ditempatkan dalam suatu kolom tertutup dan juga fasa geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan cepat kedalam kolom dengan bantuan pompa/tekanan.
Komponen pokok yang ada dalam alat HPLC :


Gambar 5 Skema Kromatografi
Keuntungan HPLC
 Kerja lebih mudah dengan automatisasi dalam prosedur analisis dan pengolahan data
 Volume sampel kecil
 Daya pisah tinggi
 Merupakan metode analitis yang cepat, peka, akurat, tepat, dan reproducible
 Juga Preparatif
 Dapat digunakan untuk analisis sampel organic dan anorganik, bersifat volatile dan non-volatil, stabil dan tidak stabil secara thermal.
 Pilihan fasa diam dan fasa geraknya luas

III. METODOLOGI PERCOBAAN
1. Alat
Adapun alat – alat yang dibutuhkan selama percobaan ini antara lain timbangan analitik, satu set alat soxhlet, 1 buah gelas beaker 250 mL, 1 buah gelas beaker 50 mL, corong gelas, 1 buah labu ukur 50 mL, 2 buah tabung reaksi, 1 buah hot plate, pipet tetes, labu Erlenmeyer 100 mL, satu set alat Solid – Phase Extraction (SPE), HPLC, dan evaporator.

2. Bahan
Bahan – bahan yang digunakan selama percobaan ini antra lain 10 gram coklat bubuk, petroleum eter (PE), methanol, kloroform, akuades, kertas whatman 44, standar teobromin dan kafein,

3. Prosedur Kerja
a. Penentuan Kadar Asam Lemak
Batu didih dimasukkan kedalam labu alas bulat dan ditimbang. Labu alas bulat yang telah berisi batu didih dirangkai pada alat soxhlet. Kemudian 10 gram coklat bubuk diekstrak dengan soxhlet menggunakan PE selama 2 jam. PE diuapkan dari ekstrak dengan evaporator, labu alas bulat ditimbang, % lemak dalam bubuk coklat dapat ditentukan.

b. Penentuan Kandungan Teobromin dan Kafein
1) Ekstraksi
0,2 gram coklat bubuk yang telah diekstraksi ditambahkan dengan 40 mL air dan direbus selama 30 menit. Kemudian disaring dengan whatman 44, dimasukkan dalam labu takar 50 mL, sampai tanda batas dan disaring dengan whatman 44.
2) Clean Up
Kolom sep – pak C18 dikondisikan dengan 5 mL methanol dan 5 mL air. Kemudian dilewatkan dengan 5 mL larutan hasil ekstraksi, setelah itu dicuci dengan 5 mL akuades. Kolom didiamkan sampai kering. Theobromin dan kafein dielusi dari kolom dengan menggunakan 10 mL kloroform (kolom dapat diregenerasi dengan pencucian menggunakan 50 mL methanol 80% dilanjutkan dengan 2  5 mL methanol. Kloroform diuapkan dengan penangas air, residu yang terbentuk dilarutkan dengan 3 mL air. Sebanyak 20 L larutan dianalisis dengan HPLC.

IV. HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
1. Hasil Percobaan
 Rendemen lemak = 57,81 %
 Rendemen teobromin = 0,3825 %
 Rendemen kafein = 0,0045 %

2. Pembahasan
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar lemak, teobromin, dan kafein dalam bubuk coklat. Kadar lemak ditentukan dengan ekstraksi soxhlet, sedangkan kadar teobromin dan kafein ditentukan dengan HPLC.

a. Penentuan Kadar Lemak
Penentuan kadar lemak dalam bubuk coklat ditentukan melaui metode ekstraksi soxhlet. Ekstraksi soxhlet merupakan salah satu metode pemisahan yang dapat diandalkan untuk memisahkan lemak yang terdapat dalam bubuk coklat. Prinsip dari metode soxhlet ini pada dasarnya sama dengan metode ekstraksi lainnya yaitu distribusi analit diantara dua pelarut yang tidak saling bercampur. Pada percobaan ini dua pelarut yang digunakan adalah PE dan air. PE diletakkan dalam labu alas bulat, sedangkan air terdapat pada pendingin bola. Lemak merupakan senyawa organik dan bersifat nonpolar, PE juga merupakan suatu pelarut organik dan bersifat nonpolar. Karena kepolaran yang sama ini maka lemak dapat terekstrak kedalam PE. Banyaknya lemak yang terekstraksi dapat dihitung dengan mengurangkan massa labu alas bulat + batu didih setelah proses ekstraksi dengan massa labu alas bulat + batu didih setelah proses ekstraksi.
Sepuluh gram coklat bubuk dibungkus dan ditempatkan dalam “Thimble” (selongsong tempat sampel). Selanjutnya labu kosong diisi batu didih. Fungsi batu didih ialah untuk meratakan panas. Thimble yang sudah terisi sampel dimasukan ke dalam soxhlet . Soxhlet disambungkan dengan labu dan ditempatkan pada alat pemanas listrik serta kondensor. Alat pendingin disambungkan dengan soxhlet. Air untuk pendingin dijalankan dan alat ekstraksi lemak mulai dipanaskan . Ketika pelarut dididihkan, uapnya naik melewati soxhlet menuju ke pipa pendingin. Air dingin yang dialirkan melewati bagian luar kondenser mengembunkan uap pelarut sehingga kembali ke fase cair, kemudian menetes ke thimble. Pelarut melarutkan lemak dalam thimble, larutan ini terkumpul dalam thimble dan bila volumenya telah mencukupi, PE yang mengandung lemak tersebut akan turun ke labu alas bulat. Proses dari pengembunan hingga pengaliran disebut sebagai refluks. Proses ekstraksi lemak kasar dilakukan selama 2 jam. Setelah proses ekstraksi selesai, pelarut dan lemak dipisahkan melalui proses evaporasi.
Massa labu alas bulat dan batu didih sebelum diekstraksi adalah 56,90 gram, sedangkan massa labu alas bulat setelah ekstraksi soxhlet dan evaporator untuk menghilangkan PE adalah 62,69 gram. Dari hasil perhitungan didapatkan kadar lemak dalam bubuk coklat yang dianalisis adalah 57,81 %.

b. Penentuan Kadar Teobromin dan Kafein
Teobromin dan kafein merupakan senyawa alkaloid yang terdapat dalam tanaman coklat. Senyawa – senyawa tersebut tersimpan dalam biji coklat yang merupakan bahan baku pembuatan coklat bubuk. Kandungan kedua senyawa tersebut dapat menggambarkan kualitas suatu produk coklat.
Analisis terhadap teobromin dan kafein dilakukan dengan menggunakan HPLC. Untuk menganalisis kedua senyawa golongan alkaloid ini, maka digunakan sampel coklat bubuk yang telah bebas dari lemak. Hal ini dilakukan karena keberadaan lemak akan mengganggu analisis teobromin dan kafein dengan HPLC. Sebelum dianalisis dengan HPLC maka sampel diberi perlakuan awal. Perlakuan awal yang diberikan adalah Ekstraksi Fasa Padat atau yang lebih dikenal dengan Solid Phase Extraction (SPE). Teknik SPE digunakan sebagai perlakuan awal terhadap sampel coklat bubuk atau untuk clean – up terhadap sampel yang masih mengandung pengotor.
Clean – up dilakukan untuk menghilangkan pengotor – pengotor yang masih terdapat dalam sampel yang akan dianalisis. Pada proses clean – up kali ini analit yang akan dianalisis akan tertahan pada penjerap yang digunakan (pada percobaan ini penjerap yang digunakan adalah C 18), sedangkan pengotor – pengotornya akan terelusi. Analit akan tertahan pada penjerap karena analit dan penjerap sama – sama bersifat nonpolar. Selanjutnya analit yang tertahan pada penjerap akan dielusi oleh sebagian kecil pelarut organik.
Tahap pertama menggunakan SPE adalah mengkondisikan penjerap C 18 dengan pelarut metanol dan air. Pengkondisian ini dilakukan untuk membasahi permukaan penjerap dan untuk menciptakan pH yang sama, sehingga perubahan – perubahan kimia yang tidak diharapkan ketika sampel dimasukkan dapat dihindari. Selanjutnya larutan sampel dilewatkan ke penjerap, maka analit yang diharapkan akan tertahan, sedangkan pengotor – pengotornya akan terelusi. Kemudian kolom (penjerap) dicuci dengan akuades untuk menghilangkan seluruh komponen yang tidak tertahan oleh penjerap. Tahap terakhir adalah elusi teobromin dan kafein dari kolom dengan kloroform. Pada tahap ini analit yang diharapkan yaitu teobromin dan kafein akan terelusi kedalam kloroform. Kemudian kloroform diuapkan dengan pengangas air.
Setelah seluruh kloroform habis teruapkan maka yang tersisa adalah residu bewarna putih. Residu bewarna putih itu adalah teobromin dan kafein. Residu ini dilarutkan dalam 3 mL air dan sebayak 20 L nya dianalis dengan HPLC.
Waktu retensi (tR) untuk standar teobromin dan kafein adalah 3,377 dan 4,274. Dari hasil analisis menggunakan HPLC didapatkan waktu retensi untuk teobromin dan kafein masing – masing adalah 3,338 dan 3,933. Dari hasil analisis selisih antara tR standar dengan tR hasil analisis tidak lebih dari 0,5, dengan ini dapat disimpulkan bahwa sampel coklat bubuk mengandung teobromin dan kafein.
Untuk menentukan kadar teobromin dan kafein maka dibuat kurva standar antara massa teobromin dan kafein versus luas area kurvanya. Kemudian luas area yang didapat dari kromatogram hasil analisis disubstitusi kedalam persamaan kurva standar. Persamaan kurva standar untuk teobromin dan kafein berturut – turut adalah y = 4E + 08X + 47303 dan y = 1E + 09X + 75209. Dari hasil substitusi luas area terhadap persamaan kurva standar didapatkan massa teobromin dan kafein dalam 20 L sampel adalah 5,1 x 10-4 mgram dan 5,973 x 10-6 mgram. Sedangkan massa teobromin dan kafein dalam 50 mL sampel adalah 7,65 x 10-4 gram dan 9 x 10-6 gram. Rendemen teobromin dan kafein dalam bubuk coklat dapat ditentukan dari rumus berukut:

Dimana: ma = massa sampel hasil analisis
mc = massa contoh
Dari rumus diatas didapatkan rendemen teobromin dan kafein adalah 0,3825 % dan 0,0045 %. Rendemen teobromin dan kafein yang didapat ini sangat kecil dibandingkan dengan kandungan teobromin dan kafein dalam coklat yang didapat dari hasil penelitian terdahulu. Hal ini disebabkan oleh berbagai faktor antara lain faktor pengenceran, serta proses clean – up. Praktikan menduga selama proses clean – up teobromin dan kafein ikut terelusi bersama dengan pengotornya. Akan tetapi hal ini baru sekedar hipitesis awal, untuk itu praktikan menyarankan perlunya agar proses clean – up harus benar – benar dilkukan dengan hati – hati, karena hal itu sangat berpengaruh terhadap hasil analisis.



V. KESIMPULAN
1. Ekstraksi soxhlet dapat digunakan untuk menentukan kadar lemak didalam bubuk coklat
2. HPLC dapat menentukan ada atau tidaknya teobromin dan kafein dalam coklat bubuk.
3. SPE digunakan untuk preparasi sampel/clean – up sebelum dianalisis dengan HPLC
4. Kadar lemak teobromin, dan kafein dalam coklat bubuk adalah 57,81 %, 0,3825 %, dan 0,0045 %.





VI. DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2010, Petunjuk Prktikum Kimia 3, FMIPA UGM : Yogyakarta
Pengenalan alat laboratorium 25-11-2008 http://labkd.blog.ugm.ac.id/
Misra H, D. Mehta, B.K. Mehta, M. Soni, D.C. Jain. 2008. Study of extraction and HPTLC – UV Method for Estimation of Caffeine in Marketed Tea (Camellia sinensis) Granules, International Journal of Green Pharmacy : 47-51.
Sudarmi. 1997, Kafein Dalam Pandangan Farmasi, Medan: Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Sumatera Utara (USU).
Usman, Anif, 2010, Ekstraksi Fase Padat, http://lansida.blogspot.com/2010/08/ekstraksi-fase-padat.html),12 Desember 2010
Wilson, and Gisvold. 1982, Textbook of Organic Medical and Pharmaceutical Chemistry, Philadelphia: JB Lippincolt Company. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995, Farmakope Indonesia, Edisi Keempat, Jakarta: Departemen Kesehatan